Review of National Chiao Tung University-Formosa iGEM Team Project 2012

ECO-FUEL E.COLINE

(High yield isobutanol synthesis pathway)

 NCTU-Formosa merupakan salah satu tim dalam iGEM Asia 2012 yang lolos ke World Championship di MIT Amerika untuk kali pertama. Dalam tulisan ini, saya akan membahas proyek mereka tentang peningkatan produksi isobutanol (biofuel/ biobahan bakar) dengan jalur sintesis yang mereka rancang dan jalankan di E.coli = E.coline.

Untuk memaksimalkan produksi isobutanol, mereka menyeleksi beberapa strain E.coli dengan medium tumbuh, suhu, serta sumber karbon yang berbeda. Hasil yang memberikan produksi isobutanol terbaik adalah E.coli dengan strain JCL 16.

Pada jalur sintesis yang alami, empat enzim produksi isobutanol terletak pada gen yang menyebar dalam E.coli sehingga mempengaruhi efesiensi produksi isobutanol. Tim ini membuat semua gen tersebut ada dalam satu program DNA dan membuat zinc finger sehingga diharapkan dapat mempercepat produksi isobutanol.

Dalam jalur isobutanol yang mereka buat, glukosa akan diubah menjadi piruvat melalui glikolisis (terjadi secara alami dalam sel) kemudian, piruvat hasil glikolisis dikonversi menjadi isobutanol dengan menggunakan empat enzim yaitu, AlsS, ilvC, ilvD, dan KivD (Gambar 1). Namun, isobutanol dan isobutiraldehid bersifat toksik bagi sel E.coli sehingga dapat menyebabkan produksi isobutanol yang rendah. Oleh karena itu, mereka mendesain sistem pelepasan bersuhu rendah (low temperature release system) yang memungkinkan jalur sintesis dihentikan sehingga dapat diakumulasi dalam bentuk 2-ketoisovalerate. Sistem suhu rendah pada E.coli dapat memproduksi isobutanol sebelum teracun oleh isobutilaldehid (Gambar 2).

11

Gambar 1 . Enzim-Enzim yang terlibat dalam produksi isobutanol

Gambar 2 Mekanisme Low Temperature Release System

Gambar 2 Mekanisme Low Temperature Release System

Ketika E.coline mereka tumbuh pada suhu 37 0C, KivD dihambat oleh TetR dan ketika dipindahkan ke suhu < 37 0C (suhu 30 0C) KivD akan terekspresi dan menghasilkan isobutanol. Walaupun E.coli akan mati dengan keberadaan isobutanol, tapi sudah didapatkan jumlah yang cukup untuk senyawa antara (intermediate) isobutiraldehid dan isobutanol dapat diproduksi.

Penjelasannya adalah ketika berada pada suhu 37 0C, sirkuit pertama akan ditranslasi dan juga memproduksi protein TetR yang berperan sebagai inhibitor bagi promotor Ptet. Oleh karena itu, sirkuit kedua tidak akan ditranslasikan. Pada tahapan ini, dapat diperoleh senyawa intermediet berupa 2-ketoisovalerate (Gambar 3). Setelah mendapatkan jumlah yang cukup 2-ketoisovalerate, E.coli dipindahkan ke lingkungan yang bersuhu 30 0C. Pada kondisi ini ribosom tidak akan berikatan dengan ribosom binding site (RBS) dan gen TetR tidak akan ditanslasi. Sirkuit kedua pada tahap ini akan ditanslasi dan isobutanol dapat diproduksi (Gambar 4).

4

Gambar 3 Produksi isobutanol pada suhu 37 derajat celcius

5

Gambar 4. Produksi isobutanol pada suhu 30 derajat Celcius

Selain sirkuit genetik diatas tim juga mengkonstruksi protein zinc finger (bentuk tabung, warna biru) yang mengandung domain pengikatan DNA dan juga domain fungsional (Gambar 5). Domain pengikatan DNA mengenali sekuen DNA spesifik yang disebut program DNA dan berperan sebagai “tangan” yang dapat memegang/mengikat program DNA yang dibuat sehingga enzim tidak akan tersebar di dalam sel namun ada dalam satu garis (line). Hal ini tentunya akan membuat produktivitas isobutanol lebih tinggi. Zinc finger dapat berikatan dengan erat pada sekuen DNA atau RNA spesifik. Tim ini mengganti domain fungsional zinc finger dengan enzim-enzim yang mereka rancang untuk membuat protein gabungan.

Gambar 5. Desain sirkuit genetik dan zinc finger NCTU-Formosa

Gambar 5. Desain sirkuit genetik dan zinc finger NCTU-Formosa

Desain biobrick mereka untuk zinc finger mengacu dengan tim iGEM Slovenia 2010 (BBa_K323066) namun dengan koreksi dari Tim ini karena ditemukan ada delesi sepasang basa pada situs pengikatan zif268 tim sebelumnya. Tim NCTU berhasil men-submit hasil koreksi pada partregistry.org dengan kode BBa_K887011.

Gambar 6. Hasil koreksi DNA program tim iGEM sebelumnya oleh tim NCTU-Formosa

 

Mereka juga menemukan E.coli pada suhu 42 0C dalam 24 jam menghasilkan produksi isobutanol yang lebih tinggi/banyak dibandingkan pada suhu 37 0C (suhu awal). Hasil ini di luar harapan dari tim ini dan sangat mengejutkan.

Pencapaian tim NCTU-Formosa dalam bidang desain Biobrick :

  • Berhasil mengkonstruksi Biobrick untuk produksi isobutanol (BBa_K887002)
  • Berhasil Mengembangkan Biobrick untuk produksi isobutanol (BBa_K887000)
  • Berhasil DNA Program Correction (BBa_K887011)

Pencapaian tim NCTU-Formosa dalam bidang Human Practice :

  • Mengadakan acara Bio-Camp untuk pelajar sekolah menengah
  • Bekerja sama dalam iGEM dengan universitas lain, NYMU, NTU, dan NTHU
  • Mengadakan survei tentang Biologi Sintetik
  • Bekerja sama dengan Dept. Komunikasi dan Teknologi NCTU dalam pembuatan film singkat tentang Biologi Sintetik
  • Membuat L-Shaped Folder untuk mempromosikan iGEM dan proyek mereka kepada dunia.

Wiki tim NCTU-Formosa : http://2012.igem.org/Team:NCTU_Formosa

Sekian dan Semoga Bermanfaat

Go Synthetic Biology !!

Advertisements

Leave a Comment

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s